摘要：目的研究水杨酸（salicylicacid，SA）和茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）对远志愈伤组织生长和相关酶活性及化学成分的影响。方法以远志继代愈伤组织为材料，加入SA（0、4、8、12、16、20、24、28、32mg/L）和MeJA（0、、、、、、0μmol/L）不同浓度下暗培养30d后，测定远志愈伤组织生长量、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性、总酚、总黄酮含量及远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量。结果MeJA对远志愈伤组织的生长具有抑制作用，12mg/L水杨酸（SA）对远志愈伤组织的生长具有促进作用。SA和MeJA对远志愈伤组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量均具有促进作用，且随着SA和MeJA浓度的增大，SOD、CAT、POD活性先上升后下降，MDA含量持续上升。SA质量浓度为20mg/L时，CAT、SOD活性达到最大值，分别为.45、.06U/mg，SA质量浓度为16mg/L时，POD活性达到最大值，为7.22U/mg；SA质量浓度为32mg/L时，MDA含量达到最大值，为25.09nmol/mg；MeJA浓度为μmol/L时，CAT、SOD、POD活性达到最大值，分别为.30、.06、15.27U/mg；MeJA浓度为0μmol/L时，MDA含量达到最大值，为27.10nmol/mg。SA对远志愈伤组织中总黄酮的积累具有抑制作用，对总酚无显著影响；MeJA对远志愈伤组织中总酚、总黄酮的积累具有促进作用，MeJA浓度为μmol/L时，总黄酮含量最高；MeJA浓度为μmol/L时，总酚含量最高。SA和MeJA均对远志愈伤组织中远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖的积累具有促进作用，SA浓度为32mg/L时，远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量最高；MeJA浓度为0μmol/L时远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量最高。结论MeJA对远志愈伤组织生长具有抑制作用，12mg/L的SA对其具有促进作用。SA和MeJA对SOD、POD、CAT活性，MDA含量及远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖的积累均具有促进作用。SA对远志愈伤组织中总黄酮的积累具有抑制作用，对总酚无显著影响，MeJA对远志愈伤组织中总酚、总黄酮的积累具有促进作用。
远志来源于远志科（Polygalaceae）远志属PolygalaLinn.植物远志PolygalatenuifoliaWilld.或卵叶远志PolygalasibiricaL.的干燥根。具有安神益智、祛痰消肿的功效，临床主要用于心肾不交、失眠多梦等症[1]。远志主要分布在中国西北、华北和东北地区，陕西、山西为其栽培的主产区[2]。远志作为我国的常用中药，其市场需求量日益增大，而近年来，远志种植过程中存在种质资源不清、根腐病等问题，使得远志栽培面积锐减，主产区远志原材料品质下降[3]，影响远志的可持续发展。植物组织培养技术能够以少量的材料，在短时间内进行大量愈伤组织诱导且不受环境影响[4]，目前已应用于多种植物的快速繁殖中，如白及[5]、黄精[6]等。
在植物组织培养过程中加入不同种类诱导子来提高药用植物次生代谢产物或有效成分的含量已成功应用于雷公藤[7]、黄芪[8]等多种中药材中。水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）作为非生物诱导子[9]，在植物次生代谢过程中以特定的生化信号快速地、选择性地诱导特定基因表达，调节植物细胞的次生代谢产物合成[10-12]，其在黄芩[13]、北沙参[14]、三七[15]等多种药用植物次生代谢产物的诱导中得以应用。本实验以远志继代愈伤组织为材料，添加不同浓度SA和MeJA进行处理，探讨SA和MeJA对远志愈伤组织生长、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性、总酚、总黄酮含量及远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量的影响，为远志愈伤组织的优良品系培养及次生代谢产物的生产提供一定的参考数据。
1材料与仪器
1.1材料
MS基本培养基（北京康倍斯科技有限公司，批号BK）；2,4-D、6-BA、NAA（上海蓝季生物有限公司，批号分别为B、B、B）；SA（源叶生物科技有限公司，批号Z22J9Y）；MeJA（Sigma-Aldrich公司，批号）；对照品远志酮III（批号，质量分数≥98%）、3,6′-二芥子酰基蔗糖（批号，质量分数≥98%）均购于中国食品药品检定研究院；色谱级乙腈（赛默飞世尔科技有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；蛋白定量、总超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、MDA试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。
远志种子采集于陕西省淳化县远志规范化栽培基地，经陕西中医药大学胡本祥教授鉴定为远志PolygalatenuifoliaWilld.的种子。
1.2仪器
生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；SW-CJ-1FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；GR60DA型立式自动压力蒸汽灭菌器（厦门致微仪器有限公司）；FA型电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；Waterse-高效液相色谱仪；色谱柱Agilent5TC-C18（2）；检测器（WatersPDADetector）；KQ-DE型数控超声波清洗器；Waters-CERTIFIED液相小瓶；移液枪；0.22μm微孔滤膜；0mL过滤装置。
2方法
2.1远志愈伤组织培养
选取优质饱满、大小基本一致的远志种子，轻轻揉搓掉其种子表层的细小绒毛，无菌水浸泡6h，将浸泡好的种子置于无菌操作台上用10%H2O2处理10min，无菌水洗后吸干其表面水分，接种于不添加任何激素的MS固体培养基中，于光照强度0lx，光照条件12h/d的（25±1）℃生化培养箱中培养，待无菌培养至苗高7～8cm时，选择生长旺盛的远志无菌苗，于洁净操作台中将叶片切为0.5cm×0.5cm的方块接种于MS＋2,4-D3.0mg/L＋NAA1.0mg/L＋6-BA1.5mg/L激素配比的培养基中，于温度为（25±1）℃，湿度保持在60%～70%的黑暗条件下诱导培养20d，将获得的远志愈伤组织继代培养2次后，作为本实验的实验材料。
2.2SA诱导处理远志愈伤组织
定量称取新鲜的远志愈伤组织，接种至添加质量浓度为0、4、8、12、16、20、24、28、32mg/LSA的培养基中（培养基配方为MS＋2,4-D3.0mg/L＋NAA1.0mg/L＋6-BA1.5mg/L＋琼脂7g/L＋蔗糖30g/L），25℃暗培养30d，每个质量浓度设置3个重复。
2.3MeJA诱导处理远志愈伤组织
定量称取新鲜的远志愈伤组织，接种至添加浓度为0、、、、、、0μmol/LMeJA的培养基中（培养基配方同“2.2”项），25℃暗培养30d，每个摩尔浓度设置3个重复。
2.4远志愈伤组织生长量的测定
将经SA和MeJA诱导培养30d的远志愈伤组织从培养瓶中取出，洗净后用滤纸吸去表面水分，称其愈伤组织质量记为鲜质量，于40℃烘箱中烘至恒定质量，称其质量记为干质量。分别以SA和MeJA浓度为横坐标，远志愈伤组织生长鲜质量和干质量为纵坐标，绘制远志愈伤组织生长曲线。
2.5抗氧化酶活性测定
SOD活性测定采用羟胺法，POD活性测定采用愈创木酚法，CAT活性测定采用可见光法，MDA含量测定采用TBA法，具体操作方法参照试剂盒说明书。
2.6总黄酮的测定
2.6.1供试品溶液的制备取愈伤组织于40℃烘箱中烘至恒定质量，研细，过40目筛，精确称取0.1g至具塞三角瓶中，精密加入75%乙醇5mL，浸泡30min后超声处理45min，滤过。滤渣中精密加入3mL75%乙醇超声30min，滤过。合并2次滤液，至10mL量瓶中，用75%乙醇定容，备用。
2.6.2对照品溶液的制备以芦丁为对照品。精密称取芦丁对照品3.32mg，用75%乙醇溶解并定容至10mL量瓶中，得质量浓度为0.mg/mL的芦丁对照品溶液。
2.6.3标准曲线的绘制取上述芦丁对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL的离心管中，加75%乙醇至2.6mL，加5%亚硝酸钠溶液0.6mL，混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液0.6mL，混匀，放置6min，加4%氢氧化钠溶液2.1mL，摇匀，放置20min，在nm处测定吸光度（A）值，以A值为纵坐标（Y），以芦丁质量浓度为横坐标（X），绘制芦丁标准曲线方程为Y＝9.X＋0.，r＝0.。
2.6.4样品测定取“2.6.1”项下所得的供试品溶液2.6mL于10mL离心管中，按“2.6.3”项下芦丁对照品溶液测定方法测定供试品A值，计算总黄酮含量。
2.7总酚的测定
2.7.1供试品溶液的制备同“2.6.1”项下方法。
2.7.2对照品溶液的制备以没食子酸为对照品。精密称取没食子酸对照品4.64mg，用75%乙醇溶解并定容至5mL量瓶中，得质量浓度为0.mg/mL的没食子酸对照品溶液。
2.7.3标准曲线的绘制取上述没食子酸对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL量瓶中，用75%乙醇定容。分别取不同浓度的没食子酸对照品溶液0.2mL，于10mL的离心管中，分别加入3.8mL纯净水、1mL的1mol/L福林酚试剂，静置30s，再加3mL的5%NaCO3溶液，混匀，40℃恒温水浴1h，摇匀，于nm处测定A值，以A值为纵坐标（Y），以没食子酸质量浓度为横坐标（X），绘制没食子酸标准曲线方程为Y＝.27X－0.，r＝0.。
2.7.4样品测定取“2.7.1”项下所得的供试品溶液0.2mL于10mL离心管中，按“2.7.3”项下没食子酸对照品溶液测定方法测定供试品A值，计算总酚含量。
2.8远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量测定
2.8.1供试品溶液的制备取愈伤组织于40℃烘箱中烘至恒定质量，研细，过40目筛，精密称取0.g，置于4mL离心管中，精密加入70%甲醇3mL，称定质量，超声处理30min，待冷却至室温后再次称定质量并补足减失的质量，摇匀，离心10min，上清液经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即为供试品溶液。
2.8.2对照品溶液的制备精密称取远志酮III对照品2.0mg、3,6′-二芥子酰基蔗糖对照品3.3mg，加甲醇制成质量浓度分别为0.2、0.33mg/mL的远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖混合对照品溶液。
2.8.3色谱条件乙腈-0.05%磷酸水溶液（20∶80）为流动相，等度洗脱，体积流量1.0mL/min，检测波长nm，柱温30℃，运行时间30min，色谱图见图1。
2.8.4标准曲线的绘制取“2.8.2”项下混合对照储备液，在“2.8.3”项色谱条件下，以进样量为1、2、4、6、8、10μL进行测定，以峰面积（Y）对进样量（X）作标准曲线，计算回归方程，远志酮III为Y＝.2X－.，r＝0.；3,6′-二芥子酰基蔗糖为Y＝5732902.0X－.，r＝0.。
2.9数据处理与分析
采用Microsoftexcel软件对数据处理，SPSS19.0软件进行单因素方差分析，Original8.0绘制相应的图表。
3结果与分析
3.1SA和MeJA对远志愈伤组织生长的影响
不同浓度SA与MeJA对远志愈伤组织生长量的影响见表1。由表1可知，远志愈伤组织接种于添加不同质量浓度SA或MeJA的培养基上培养30d后，其生长量都有不同程度的增加。与对照组相比，当SA质量浓度为12mg/L时远志愈伤组织鲜质量和干质量达到最大值，分别为2.、0.g，显著高于对照组的鲜质量和干质量，说明质量浓度为SA12mg/L对远志愈伤组织生长表现出促进作用。远志愈伤组织接种于添加不同质量浓度MeJA的培养基上培养30d后，其鲜质量和干质量虽有增加，但均显著低于不加MeJA的对照组，说明MeJA对远志愈伤组织生长具有抑制作用。
3.2SA和MeJA对远志愈伤组织中抗氧化酶活性及MDA含量的影响
不同浓度SA和MeJA对远志愈伤组织中SOD、POD、CAT活性及MDA含量的影响见图2，图中同一条线上不同字母分别表示差异显著（P＜0.05）。由图2可知，随着SA和MeJA浓度的增大，SOD、POD、CAT活性整体上均呈先上升后下降的趋势，且均高于对照组。当SA质量浓度为20mg/L时，CAT、SOD活性达到最大值，分别为.45、.06U/mg，是对照组的2.43、4.90倍，当SA质量浓度为16mg/L时，POD活性达到最大值，为7.22U/mg，是对照组的8.20倍。
当MeJA浓度为μmol/L时，CAT、SOD、POD活性达到最大值，分别为.30、.06、15.27U/mg，是对照组的2.27、4.22、8.12倍。随着SA和MeJA浓度的增大，MDA含量均呈上升趋势，当SA质量浓度为32mg/L时，MDA含量达到最大值，为25.09nmol/mg，是对照组的13.21倍。当MeJA浓度为0μmol/L时，MDA含量达到最大值，为27.10nmol/mg，是对照组的9.41倍。
3.3SA和MeJA对远志愈伤组织中总酚、总黄酮的影响
不同浓度SA和MeJA对远志愈伤组织中总酚、总黄酮的影响见表2。由表2可知，不同SA浓度下远志愈伤组织中总黄酮含量均低于不加SA的对照组；总酚含量相较于对照组无显著性差异，说明SA对远志愈伤组织中总黄酮的产生具有抑制作用，对总酚的产生无显著影响。MeJA不同浓度下远志愈伤组织中总酚、总黄酮含量随MeJA浓度增大呈先增加后下降的趋势，在MeJA浓度为μmol/L时，总黄酮含量达到最大值，为26.mg/g，是对照组的1.77倍；在MeJA浓度为μmol/L时，总酚含量达到最大值，为10.mg/g，是对照组的1.89倍。MeJA不同浓度下远志愈伤组织中总酚、总黄酮含量均显著高于不加MeJA的对照组，说明MeJA能够有效刺激远志愈伤组织中总酚、总黄酮含量的积累。
3.4SA和MeJA对远志愈伤组织中远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量的影响
SA和MeJA不同浓度对远志愈伤组织中远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量的影响见图3。由图3可得，远志愈伤组织接种于添加不同浓度SA或MeJA的培养基上培养30d后，远志愈伤组织中远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量均显著高于不加SA或MeJA的对照组。当SA质量浓度为32mg/L时，远志愈伤组织中远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量最高，分别为.78、22.28μg/g，但3,6′-二芥子酰基蔗糖含量与SA质量浓度为24mg/L时不存在显著性差异。当MeJA浓度为0μmol/L时远志愈伤组织中远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量达到最大值，分别为.89、.27μg/g。
4讨论
利用植物愈伤细胞生产用于预防和治疗疾病的植物次生代谢产物发展极为迅速，近年来已研究多种植物，并从培养细胞中分离得到多种次生代谢产物[16]。通过外源诱导子的添加改变植物的次生代谢途径，是提高植物次生代谢产物的有效方法之一[14]。SA和MeJA在植物发育过程和抵御不良环境中起着重要的内源激素作用[17]，并以信号分子形式参与植物次生代谢、激活相应防御基因、调控相关关键酶基因表达、影响酶活性，从而调控次生代谢产物的产生[18]。本实验考察了不同浓度SA和MeJA对远志愈伤组织生长、相关酶活性及化学成分的影响。实验结果表明，MeJA对远志愈伤组织的生长具有抑制作用，SA12mg/L对远志愈伤组织的生长具有促进作用，说明一定浓度的SA和MeJA可能对活细胞具有毒性，从而抑制其生长。
SOD、POD及CAT是植物体内广泛存在的抗氧化酶，SOD可以将植物体内有毒的超氧阴离子转化为H2O2，POD和CAT可以及时清除细胞内过量H2O2，从而抵御过氧化物的破坏[2]。本实验结果表明，随着SA和MeJA浓度的增大，SOD、CAT、POD活性均呈先上升后下降的趋势，与黄芩[19]、栓皮栎[20]等植物中研究一致，说明SA和MeJA对愈伤组织的生长能够产生胁迫作用，使愈伤细胞内的抗氧化酶系统协同调控，以减少超氧阴离子及过氧化物的过量积累，但过高的SA和MeJA浓度下，超氧阴离子及过氧化物的积累超过抗氧化酶系统的清除能力，从而对其产生伤害导致抗氧化酶活性降低。MDA是膜质过氧化的产物，其含量高低反映膜质过氧化程度的大小[21]。本实验中，随着SA和MeJA胁迫浓度的增大，MDA含量逐渐增加，分析原因可能是，H2O2含量增加导致愈伤细胞膜质过氧化程度逐渐加重，MDA含量也持续上升。
不同浓度SA对远志愈伤组织中总黄酮的产生呈现出抑制作用，对远志愈伤组织中总酚的产生不存在显著影响。MeJA对远志愈伤组织中总酚、总黄酮含量均有一定的促进作用，当MeJA浓度为μmol/L时，总黄酮含量达到最大值，在MeJA浓度为μmol/L时，总酚含量达到最大值。MeJA浓度为μmol/L时与MeJA浓度为μmol/L时，远志愈伤组织中总黄酮含量无显著性差异，因此本实验认为以加入μmol/L的MeJA，可作为远志愈伤组织总酚、总黄酮含量积累的最佳浓度。
不同SA和MeJA浓度对远志愈伤组织中远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量均具有促进作用。在SA质量浓度为32mg/L时，远志愈伤组织中远志酮III，3,6′-二芥子酰基蔗糖含量最高，在MeJA浓度为0μmol/L时远志愈伤组织中远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量达到最大值；综合来看，MeJA对远志愈伤组织中远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量积累的影响高于SA，尤以MeJA浓度为0μmol/L时效果最佳。
实验通过不同浓度SA和MeJA对远志继代愈伤组织生长、MDA含量、抗氧化酶活性、总酚、总黄酮含量及远志酮III、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量影响的研究，为远志愈伤组织的优良品系培养及次生代谢产物的生产提供一定的参考数据。
参考文献（略）
来源：李洁，胡本祥，彭亮，杨冰月，罗露，曹福麟，颜永刚，张岗.水杨酸和茉莉酸甲酯对远志愈伤组织生长和相关酶活性及化学成分的影响[J].中草药,,50(12):-.
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