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[摘要]：目的研究不同产地野生远志Polygalatenuifolia中5种主要成分的含量差异，为远志多成分质量评价体系提供基础。方法采用HPLC法测定20个产地野生远志中远志酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酸、远志皂苷元和细叶远志皂苷的含量，运用SPSS20.0和SIMCA11.5进行差异性、聚类、相关性和主成分分析。结果不同产地野生远志中5种主要成分的含量差异显著，聚类分析和主成分分析可将所有样品聚为2类，第Ⅰ类所含3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酮Ⅲ、远志皂苷元和细叶远志皂苷含量较高，来自陕西渭南、陕西咸阳和山西新绛，其余样品则聚为第Ⅱ类。结论陕西渭南、陕西咸阳和山西新绛所产野生远志中主要成分含量较高，与其他产地存在极显著性差异，可为远志质量评价、优良种质及栽培基地选择等提供依据。[关键词]：远志；质量评价；远志酮Ⅲ；3，6′-二芥子酰基蔗糖；远志酸；；远志皂苷元；细叶远志皂苷远志为远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld.的干燥根，系我国常用大宗中药材品种之一，始载于《神农本草经》，被列为上品。远志味苦、辛，性温，归心、脾、肾经，具有安神益智，祛痰消肿之功效，有“养命之要药”之称，临床上多用于治疗心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸等症。现代药理研究表明，远志具有抗抑郁、抗痴呆、脑保护活性、抗心肌缺血、抗肿瘤等作用，主要活性成分为皂苷类、酮类、寡糖酯类，其中皂苷类成分主要有远志皂苷元、细叶远志皂苷、远志酸、远志皂苷B等；酮类成分主要为远志酮III；寡糖酯类成分主要为3，6′-二芥子酰基蔗糖。《中国药典》年版收载的远志和饮片以远志酮III、酰基蔗糖以及远志皂苷元的含量来作为控制质量的成分标准，相关研究也多数对远志酮III、酰基蔗糖以及远志皂苷元的含量进行检测，但是远志中还含有很多其他的有效成分，如远志酸和细叶远志皂，此2种成分在远志中含量客观且具有较好的药理活性。因此，为了更全面地控制远志的质量，结合远志酸、细叶远志皂与药典指标性成分来评估远志质量具有重要意义。近年来，随着人们对远志药理活性尤其是抗抑郁、抗痴呆等研究的不断深入，其开发利用的领域越加宽广，市场需求量和出口量不断增加，人工栽培面积不断扩大，野生资源也开始匮乏。同时，由于远志药材受产地、栽培条件、加工方法、药用部位（药典收载为远志根，市售药材则多以抽去木心的远志筒为主），使其质量参次不齐，对于其优良种质的筛选与评价极为需求。目前，远志的研究仍集中于化学成分、药理作用、栽培品远志的品质评价且含量测定多以药典指标为主，对于野生远志的质量评价研究较少。基于此，本研究以全国远志主要分布区野生远志为研究对象，采用HPLC法测定不同来源野生远志中远志酮III、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酸、远志皂苷元和细叶远志皂苷的含量，以期为多成分综合评价远志药材品质、筛选优良远志种质及种植基地选择提供数据支持和理论依据。1仪器、试剂与材料1.1仪器电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Waterse-高效液相色谱仪；色谱柱Agilent5TC-C18(mm×4.6mm，5μm）；检测器（WatersPDADetector)；KQ-DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA型电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）。1.2试剂远志口山酮III（批号，质量分数≥98%）、远志酸（批号，质量分数≥96.5%）、远志皂苷元（批号702，质量分数≥98.7%）、细叶远志皂苷（批号04，质量分数≥95.6%）购于中国食品药品检定研究院；3，6′-二芥子酰基蔗糖对照品（批号，质量分数≥98%）购自北京北纳创联生物技术研究院；色谱级乙腈、甲醇、磷酸（赛默飞世尔科技有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯（天津市天力化学试剂有限公司）。1.3材料野生远志采挖于陕西、河北、河南、山西、甘肃、山东等地，药材详细信息见表1，经陕西中医药大学药学院胡本祥教授鉴定为远志PolygalateruifoliaWilld.的干燥根。2方法与结果2.1对照品溶液的制备分别精密称取远志口山酮III对照品2.20mg、3，6′-二芥子酰基蔗糖对照品2.50mg、远志酸对照品6.50mg、远志皂苷元对照品6.0mg、细叶远志皂苷元对照品3.0mg，置于量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，临进样前用0.22μm微孔滤膜滤过，即得含远志口山酮III0.22mg/mL、3，6′-二芥子酰基蔗糖0.25mg/mL、远志酸0.65mg/mL、远志皂苷元0.24mg/mL、细叶远志皂苷0.30mg/mL的混合对照品溶液。2.2供试品溶液的制备2.2.1远志口山III、3，6′-二芥子酰基蔗糖测定供试品溶液的制备酮精密称取药材粉末（过6号筛）约1.g，置于50mL三角瓶中，加入70%甲醇25mL，称定质量，加热回流1.5h，待冷却至室温后再次称定质量并补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液于25mL量瓶中并定容至刻度，进样前过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。2.2.2远志酸、远志皂苷元测定供试品溶液的制备精密称取药材粉末（过6号筛）约1.g，置于50mL三角瓶中，精密加入60%乙醇15mL，称定质量，超声处理30min，待冷却至室温后摇匀，滤过，取续滤液于10mL于蒸发皿中，将其蒸干，再加入10mL10%HCL溶解皿底渣滓，再转移至50mL锥形瓶中沸水加热回流2h，冷却至室温过滤，可得褐色沉淀于滤纸上，再用甲醇溶解定容至25mL量瓶中，进样前过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。2.2.3细叶远志皂苷测定供试品溶液的制备精密称取本品粉末（过6号筛）0.g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50mL，超声处理1h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，置于蒸发皿中，将其蒸干，残渣加10%氢氧化钠溶液25mL，加热回流2h，放冷，用盐酸调节pH值为4～5，用水饱和的正丁醇溶液振摇萃取3次，每次50mL，最后合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加甲醇适量溶解并转移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度并摇匀，进样前过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。2.3色谱条件2.3.1远志口山酮III、3，6′-二芥子酰基蔗糖含量测定参照《中国药典》年版第一部远志项下的高效液相色谱法测定。色谱条件：乙腈-0.05%磷酸（20∶80）为流动性，等度洗脱。体积流量1.0mL/min，检测波长nm，柱温30℃，进样量10μL；运行时间30min。色谱图见图1。2.3.2远志酸、远志皂苷元含量测定参照《中国药典》年版第一部远志项下的高效液相色谱法测定。色谱条件为以乙腈-0.1%磷酸水溶液（41∶59）为流动相，等度洗脱，体积流量lmL/min；检测波长nm；柱温30℃，进样量10μL；运行时间40min。色谱图见图2。2.3.3细叶远志皂苷含量测定参照《中国药典》年版第一部“远志”项下的高效液相色谱法测定。色谱条件为以甲醇-0.05%磷酸溶液（70∶30）为流动相，等度洗脱，体积流量lmL/min；检测波长nm；柱温30℃，进样量10μL；运行时间15min，见图3。2.4线性关系考察取远志酮III、3，6′-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷、远志酸及远志皂苷元对照品溶液，分别进样，按上述色谱条件注入色谱仪，记录峰面积，分别以各成分的峰面积（Y）对进样量（X，μg）作回归分析，计算回归方程，见表2。2.5精密度试验精密称取已干燥至恒定质量的同一产地远志粉末（XY)1.g，按“2.2”项下方法分别制样，在“2.3”项下，重复进样6次进行测定并计算各对照品峰面积变化情况，结果显示远志酮III、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酸、远志皂苷元和细叶远志皂苷峰面积的RSD分别为1.09%、1.08%、0.80%、0.42%和0.12%。2.6稳定性试验取同一供试品溶液（XY）适量，在0、2、4、8、12、24h6个时间点精密吸取10μL，按“2.3”项下条件分别测定并计算对照品峰面积变化情况，结果显示远志酮III、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酸、远志皂苷元和细叶远志皂苷峰面积的RSD分别为0.82%、0.69%、1.04%、0.95%和1.25%。2.7重复性试验精密称取同一产地远志粉末（XY）共6份，各约1.g，按“2.2”项下方法分别制样，在“2.3”项下的条件下测定并计算样品中5种成分的含量变化情况，结果显示远志样品中远志酮III、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酸、远志皂苷元和细叶远志皂苷质量分数的RSD分别为0.69%、0.58%、0.69%、0.58%和0.85%。2.8加样回收率试验精密称取已知含量远志粉末（XY）共6份，按“2.2”项下方法分别制样，并精密加入已知浓度的远志酮III、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酸、远志皂苷元和细叶远志皂苷对照品溶液各3mL，在“2.3”项下的色谱条件进行测定，计算加样回收率。远志酮III、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酸、远志皂苷元和细叶远志皂苷加样回收率分别为98.42%、98.98%、98.14%、97.95%和98.89%，RSD分别为1.64%、1.51%、1.13%、1.15%、1.36%。2.9样品含量测定取20个不同产地的远志（每产地随机选取5个单株，按单株粉碎后分别进行含量测定），按“2.2”项下方法分别制样，按“2.3”项下条件检测，记录峰面积，并计算各成分质量分数，结果见表3。3结果分析采用SPSS20.0统计软件进行显著性差异分析、相关性分析和聚类（HCA）分析，数据统计分析，并以5个主要活性成分含量为变量，将数据导入SIMCA-P13.0软件进行主成分分析（PCA）。3.1主要成分含量差异性分析由表3可知，不同产地远志野生药材的5种主要成分含量存在差异。远志酮III的质量分数为0.%～0.%，以甘肃庆阳产远志中质量分数最高（0.%），陕西渭南次之（0.%），与其余18个产地存在极显著性差异（P0.01）；其余产地远志中远志酮III质量分数无显著性差异，以甘肃临夏、河北保定、河北承德、河北秦皇岛4个产地的含量最为接近。3，6′-二芥子酰基蔗糖的质量分数为0.%～1.%，以河北秦皇岛产远志中质量分数最高（1.%），陕西渭南次之（1.%），与其余18个产地存在极显著性差异（P0.01）。远志酸的质量分数为0.%～2.%，以陕西咸阳产远志中质量分数最高（2.%），与其余19个产地存在极显著性差异（P0.01），河南郑州、陕西渭南、河北保定、河北秦皇岛、山西闻喜、甘肃平凉的远志酸质量分数依次降低，6个产地之间不存在极显著性差异，以甘肃临夏产远志中质量分数最低（0.%）。远志皂苷元的质量分数为1.%～2.%，以山西新绛县产远志质量分数最高（2.%）；甘肃、河北产远志含量尤其稳定，集中在2.0%～2.1%；河南郑州产远志皂苷元质量分数最低（1.%），与其余19个产地存在极显著性差异（P0.01）。细叶远志皂苷的质量分数为1.%～3.%，以陕西渭南产远志质量分数最高（3.%），山西新绛县的质量分数次之（3.%），二者间无极显著性差异P0.01），河南洛阳产远志的细叶远志皂苷质量分数最低为（1.%）。3.2聚类分析将20个不同产地远志野生药材中5种主要成分的含量数据导入SPSS20.0统计软件，Z标准化后选用组内联接聚类法，以欧式平方距离度量标准，计算样品相似度。聚类结果表明，当欧式平方距离为22时，所有样品首先聚为2大类，渭南、新绛、咸阳样品聚为第II大类，其余17个产地均聚为第I大类，见图4。当欧式平方距离为12时，第I大类可分为3个小类，石家庄、洛阳、承德样品聚为Ib类，保定、秦皇岛、郑州聚为Ic类，其余则聚为Ia类。3.3PCA将20批远志样品中5个主要成分含量平均值为变量，得到20×5阶数据矩阵。采用SIMCA-P13.0统计软件对收集的20批野生远志样品进行PCA。前3个主成分的累积贡献率达到78.%，说明前3个因子在反映产地与共有成分的相互关系中起主导作用，能够揭示样品中大多数的变异信息（表4）。提取前3个主成分作得分图，见图5，可知PCA得分图能够很好地将不同产地远志样品区分开来（图中每个点代表一个产地），所有远志样品聚为2大类，陕西咸阳、陕西渭南和山西新绛聚为第I类，其余17个产地聚为第II类，与聚类分析的分类结果一致，表明20个产地远志的内在质量特征稳定，分类清晰，2种方法均为归纳反映药材质量特性和综合分类的有力判断手段，当进行复杂样本的分析时可相互印证。3.4相关性分析利用SPSS20.0作不同成分含量及药材性状间的相关性分析，结果见表5，远志酮III与株高之间存在显著性相关关系，远志酸与根粗之间存在极显著性相关关系，远志皂苷元与株高之间存在显著性相关关系，细叶远志皂苷与根粗之间存在极显著性相关关系，3，6′-二芥子酰基蔗糖与上述指标均无相关性关系。可知，远志成分含量的高低与其根粗、株高的关系相近，也从侧面反映了药材质量优劣与其外观性状之间存在一定的相关性。4讨论本研究以来源于不同产地的远志野生药材为研究对象，测定了药材中的远志酮III、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酸、远志皂苷元、细叶远志皂苷5种有效成分的含量，对药材有效成分提取研究思路避免了常规混合打粉提取的模糊性和混沌性，以单株为对象进行含量分析，试图最大程度地反映具体药材的品质评价，使药材研究结果更有具体性和准确性，一定程度上可以宏观估算各产地远志药材的蕴藏量以及有效成分的总体含量。研究结果表明，糖酯和酮类成分易受外界因素的影响，远志酮III、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酸、细叶远志皂苷4种成分的含量在不同产地间差异显著。远志皂苷元的质量则较为稳定，20个产地中有18批远志的皂苷元质量分数在2.00%～2.20%，推测其成分受不同地理环境的影响较弱。因此，采用多指标含量测定的方法来评价远志药材的质量更为科学。分析含量测定结果可知，陕西渭南、咸阳，山西新绛所产野生远志中3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志酮III、远志皂苷元和细叶远志皂苷含量较高，优于其他产地，表现为整体质量优、品质佳，可作为远志基地规范化种植及优良种质筛选的优选地区。而陕西和山西作为远志的道地产区和主产区，较早就开始了远志的栽培种植，所产远志品质优良，与本研究结果一致。同时，不同产地远志的主要成分含量差异明显，同一省份不同区域的样品主要成分含量差异也较大，分析其原因可能与生长环境、气候或生长年限有关，建议远志药材在市场流通时，须尽可能清楚地注明产地、生产批号等信息。产地是影响中药材质量的重要因素，具有明显的本草学特点。大多数药材经过千百年来的筛选，已将产地和中药质量紧密结合在一起，优质药材的产地为“道地”。远志药材遍布全国，不同地理位置对应着不同环境因素，其差异必定会造成远志形态及化学成分上的差异，进而产生药效上的差异。产地所有的生态因子（立地因素）均与药材质量有关，包括土壤、气温、降雨、光照、生态群落构成等。因此，产地作为中药质量的本草学属性在中药质量评价中有着不可或缺的重要地位，本研究采集了远志主产区5个省份20个不同地区的远志样本，能在一定程度上反映其品质与产地间的关系，为远志品质评价、优良种植的筛选、种植基地的选择提供了实验数据，但其品质与气候等环境因素的相关性分析有待进一步研究。参考文献：略

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